還原糖含量試劑盒說(shuō)明書
可見分光光度法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
還原糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。植物體內(nèi)的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等，是zui常見的單糖和雙糖，其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物，也是進(jìn)一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。
測(cè)定原理：
加熱促進(jìn)堿性溶液中 3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物，在540nm 有特征吸收峰；在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖含量與540nm吸光度成線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品中還原糖的量。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：20mL×1 瓶 ，4℃保存；
樣品中還原糖的提取：
1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議1000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入2mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3S，間隔10S，重復(fù)30次），轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min 并且振蕩8~10 次，8000g，25℃離心 10min，取上清供測(cè)定用。
2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.2g
組織，加入2mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中40min 并且振蕩8~10次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。
3、血清（漿）的處理：按照血清（漿）體積（mL）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建
議取0.2mL血清（漿）加入2mL試劑一），冰浴勻漿，轉(zhuǎn)移到有蓋離心管中（防止加熱時(shí)水分散失），80℃水浴中 40min 并且振蕩 8~10 次，8000g，25℃離心10min，取上清供測(cè)定用。
測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95℃。
3、 在 EP 管中加入下列試劑：
試劑（μL） | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
樣本 | 700 | 700 |
試劑二 |
| 500 |
蒸餾水 | 500 |
|
將各管搖勻，在 95℃水浴中加熱 5min（蓋緊，防止水分散失），取出后立即冷卻至室溫，
混勻。在 540nm波長(zhǎng)下讀取對(duì)照管和測(cè)定管吸光值。計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。
注意：1、每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
2、如果 ΔA大于2，需要將樣本用試劑一稀釋，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
還原糖含量計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y =8.5067x-2.0807；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算：
還原糖 (μg/g 鮮重 )=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)
=235×(ΔA ＋2.0807)÷W
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)
=117.55 ×(ΔA＋2.0807)÷Cpr
4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
還原糖(μg/104cell)=[1000×(ΔA＋2.0807)÷8.5067×V1]÷（1000×V1÷V2）
=0.235×(ΔA＋2.0807)
5、按血清（漿）體積計(jì)算：
還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA＋2.0807) ÷8.5067×V1]÷（V3×V1÷V2）
=1175.5×(ΔA＋2.0807)
1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入樣本體積，0.7mL；V2：加入提取液體積，2 mL；V3：加入血清（漿體積），0.2mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，1000 萬(wàn)。
注意：低檢測(cè)限為 1mg/g 鮮重或 10μg/mg prot
