克倫特羅快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物克倫特羅將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗克倫特羅抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物克倫特羅的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物克倫特羅的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時間： 30min～15min
樣本檢測下限
尿 樣 0.1ppb
組 織（處理法一） 0.4ppb
組 織（處理法二） 0.1ppb
飼 料 1ppb
交叉反應率
克倫特羅（Clenbuterol） 100%
特pu他林（Terbutalin） <1%
馬布特羅(Mabuterol) <1%
溴布特羅(Brombuterol) <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） <1%
萊克多巴胺（Ractopamine） <1%
樣本回收率
尿 樣 95%±22%
組 織 75%±20%
飼 料 80%±20%
三、試劑盒組成
1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條
標準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb
3 酶標記物 7ml 紅色帽
4 抗體工作液 10ml 藍色帽
5 底物 A 液 7ml 白色帽
6 底物 B 液 7ml 黑色帽
7 終止液 7ml 黃色帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、
甲醇、無水硫酸鈉、正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制：
配液 1 0.1M HCl 溶液取 0.86ml 濃 HCl 加水定溶至 100ml。
配液 2 0.1M NaOH 溶液稱取 0.4g NaOH 加水定溶至 100ml。
配液 3 乙腈-0.1M HCl 溶液V 乙腈：VHCl =84：16。
樣本處理：
（a）尿樣本的處理方法
取 20µl 清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。 3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于樣本稀釋倍數: 1 倍 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
（b）組織樣本的處理方法一 程序中的要點。
1、稱 2±0.05g 均質后的組織至 50ml 離心管中，加 4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜入 6ml 去離子水，充分振蕩 2min，室溫 蓋住微孔板。
4000r/min 以上離心 10min(注：若組織樣本中油 u 操作步驟：
脂含量較高，可在振蕩后放入 85℃水浴 10min 1、從 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～后再離心)； 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使
2、取 20µl 上層液進行分析。 用前均須搖勻。
樣本稀釋倍數: 4 倍 2、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放
（c）組織樣本的處理方法二 入自封袋，保存于 2～8℃。
1、稱取 2 ± 0.05g 均質后的組織于 50ml 離心管 3、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每中，加入 6ml 乙腈-0.1MHCl，振蕩 2min,室溫 個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和
4000r/min 以上離心 10min； 樣本孔所在的位置。
2、取上清 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 4、加標準品/樣本 20µl/孔到各自的微孔中，然后加乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離 酶標記物 50µl/孔，再加入 80µl/孔的抗體工作心 10min。取全部上清于 50～60℃氮氣流或空 液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環境氣流吹干； 反應 30min。
3、加入 1ml 去離子水溶解干燥后的殘留物，混合 5、將孔內液體甩干，用去離子水 250µl/孔洗板 4～30s； 5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍
4、取 20 µl 用于分析。 干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
樣本稀釋倍數： 1 倍 6、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
（d）飼料處理方法 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯
1、稱1.0±0.05g 研碎的飼料樣品于50ml 離心管中， 色 15min。
加入 10ml 甲醇，再加入 5g 無水硫酸鈉，充分 7、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設振蕩 2min；15℃ 4000r/min 以上離心 10min； 定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n
2、吸出離心后的上清液 1ml，于 50～60℃氮氣流 m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。或空氣流吹干，用 1 ml 去離子水溶解干燥后的 七、結果判定殘留物，再加入 1ml 正己烷混合 30s ；15℃ 結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方4000r/min 以上離心 5min；去除上層有機相；
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與
3、取下層 20 µl 用于分析。
其所含克倫特羅量成負相關。
樣本稀釋倍數：10 1、粗略判定：
六、酶標免疫分析程序: 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出
u 測定前應須知： 其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：（20～25℃）。 0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415；
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克倫特羅實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0
（2）B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以克倫特羅標
準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克倫特羅實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
八、注意事項:
1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、該試劑盒最jia反應溫度為 25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
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