過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒說明書微量法 |
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過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒說明書 微量法 注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 規(guī) 格 ：100T/96S 產(chǎn)品內(nèi)容： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 125μL×1 瓶，4℃保存。 產(chǎn)品說明： CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的 H2O2 清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。 H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解 H2O2，使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。 需自備的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔（UV 板）、研缽、冰和蒸餾水 操作步驟： 一、粗酶液提取： 1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。二、測定步驟： 1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 240nm，蒸餾水調(diào)零。 2、CAT 檢測工作液的配制：用時(shí)在試劑二中加入 25mL 試劑一，充分混勻，作為工作液。 3、測定前將 CAT 檢測工作液在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。 4、準(zhǔn)備96孔UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測波長小于 340nm務(wù)必使用UV 板）。 5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 240nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算ΔA＝A1-A2。三、CAT 活性計(jì)算： a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下 1、血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mL)= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=459×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=459×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T=459×ΔA÷W （3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×500）÷T =0.917×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數(shù)，4.36×104L/ mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W： 樣本鮮重，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；109：單位換算系數(shù)， 1 mol=109nmol。 b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下 1、血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mL)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=764.5×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T=764.5×ΔA÷W （3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。 CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣總×500）÷T=1.529×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數(shù)，4.36×104 L / mol/ cm；d：96 孔板光徑， 0.6cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W： 樣本鮮重，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；109：單位換算系數(shù)， 1 mol=109nmol。 注意事項(xiàng)： 出現(xiàn)負(fù)值怎么辦？ 首先檢查吸光值是否超過 3，如果超過3很可能是沒有用UV 板，請換用 UV 板。如果未超過 3，仍然出現(xiàn)負(fù)值則檢查反應(yīng)過程是否產(chǎn)生氣泡，氣泡多說明酶活性太高，氣泡影響 產(chǎn)生了負(fù)值，可以將樣本用提取液稀釋 10 倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應(yīng)體系沒有產(chǎn)生 氣泡仍然出現(xiàn)較小的負(fù)值，說明該樣本測不到該酶活。 從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。 實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)： |
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